Cómo identificar una glicoproteína A través de un reactivo Bradford

glicoproteínas son proteínas con hidratos de carbono unidos a ellos. Al igual que con todas las proteínas , puede utilizar el reactivo de Bradford para determinar si son glicoproteínas en una solución y calcular su concentración. El reactivo de Bradford es un colorante que se forma un complejo entre las proteínas en solución y el reactivo de azul brillante G, haciendo que los tres para unirse juntos. El complejo , cuando se lee con un espectrómetro , se absorben luz a un máximo de 595 nm , en lugar de 465 nm, que es la longitud de onda a la que Bradford reactivo por sí mismo absorbería . La cantidad de absorción es proporcional a la cantidad de proteína (o glicoproteína , según sea el caso ) en los solution.Things que necesitará
espectrofotómetro de luz
placa de ensayo
Micropipetas
mostrar Más instrucciones Matemáticas 1

Caliente el espectrofotómetro. Encenderlo y dejar actuar durante al menos 15 minutos antes de usarla .
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Preparar "normas" en la placa de ensayo . Las normas son las soluciones que contienen cantidades conocidas de la glicoproteína para el que se le probando su compuesto experimental . La obtención de lecturas de absorbencia de estas normas conocidas y, posteriormente, una curva de calibración que las parcelas conocidas concentración frente a la absorbancia , le permitirá cuantificar la cantidad de proteína en las muestras desconocidas.

Para preparar sus normas , llene todos los 12 pozos en una fila de una placa de ensayo con 100 microlitros de agua destilada , usando una micropipeta . Para el primer pozo , añadir 100 microgramos de glicoproteína con la pipeta . Utilizar una micropipeta para mezclar completamente la glicoproteína y agua destilada juntos: la pipeta hacia arriba y abajo . Esta primera , así más concentrada contiene una proporción de 50 microgramos de glicoproteína de 50 microgramos de agua . Sacar 100 microlitros de líquido mezclado a partir de ese primer pozo y pipeta en el segundo pozo . Mezcle bien con la pipeta hacia arriba y hacia abajo. La concentración de este segundo pozo es de 25 microgramos de glicoproteína a 50 microgramos de agua . Sacar 100 microlitros del pozo segundo , pipeta en el tercer pozo y repita el procedimiento para todos los pozos subsiguientes en la fila hasta llegar a la última también. El último pozo debe consistir sólo en agua destilada y tienen 0 microgramos de glicoproteína, así que no la pipeta en el último también.

En otras palabras, cada uno de los pocillos estándar debería tener 100 microlitros de líquido en ellos y debe disminuir , en el contenido de la glicoproteína , por medio cada vez, a partir de 50 microgramos a 0 microgramos.
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Coloque 100 microlitros de su compuesto desconocido en un pozo vacío de la placa de ensayo. No es necesario diluir el bien desconocido , ya que no necesita una curva de calibración a partir de lo desconocido. Por lo tanto , cada desconocido que se está probando para glicoproteínas sólo requiere de un bien en la placa de ensayo . Su desconocido debe contener una estimación de entre 5 y 100 microgramos de glicoproteína. Esta estimación se incrementa la probabilidad de que las lecturas de absorbancia de su desconocido caerán en la curva de calibración que obtenga de sus normas.
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Agregar colorante y reactivo , en cantidades especificadas por el fabricante del equipo de reactivos , para las normas y las incógnitas. Espere cinco minutos para permitir la formación del complejo .
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Lea la absorbancia de los estándares y las incógnitas en el espectrofotómetro. A partir de los estándares , obtener una curva de calibración de los valores de absorbancia frente a la concentración conocida. El espectrofotómetro debe formular automáticamente esto para usted, pero si no, hacer su propia curva . Usando un programa de gráficos --- o graficar los valores de absorbancia papel --- parcela en el eje x y la concentración conocida en el eje y. Coloque una línea de mejor ajuste a la curva de calibración para obtener la relación entre la absorbancia y la concentración.
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Enchufe sus valores de absorbancia primas para las muestras desconocidas en su fórmula de curva de calibración , para obtener la concentración de la glicoproteína en su muestra .