Cómo cambiar de IgG subclases

Inmunoglobulina G o IgG, es un anticuerpo hecho por los linfocitos B . Los anticuerpos son importantes para la inmunidad y le ayudan a defenderse de los microbios patógenos y toxinas. Anticuerpos de IgG monoclonal de ratón se producen comúnmente en el laboratorio en las líneas celulares de hibridoma y se utilizan para varias aplicaciones médicas . Los ratones tienen cuatro subclases de IgG : IgG3 , IgG1 , IgG2b e IgG2a , nombrados en el orden en que aparecen en el ADN. Un anticuerpo IgG3 puede cambiar aleatoriamente a IgG1 , que puede cambiar aleatoriamente a IgG2b y así sucesivamente . Esta conexión aleatoria se puede utilizar para aislar y producir las cuatro subclases de IgG mediante un ensayo de ELISA lugar , como se ha descrito por primera vez en un estudio publicado en " Journal of Immunological Methods . " Cosas que necesitará el equipo
estéril de células de cultivo y reactivos
línea celular secretora IgG3
placas de ELISA y reactivos
anticuerpos IgG anti -ratón , marcado y etiquetado HRP -Yahoo! Incubadora
capilla de
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el crecimiento de su anticuerpo IgG3 de los padres en la línea celular de hibridoma . Comience con la subclase IgG3 para obtener las cuatro subclases. Subclase de conmutación que ocurre en el orden de los genes de IgG se producen en el ADN . Una vez que la línea celular cambia de una a otra subclase , la primera ( parental ) gen subclase se pierde a partir del ADN . Conmutación subclase no puede suceder en el orden inverso .
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Plate la línea celular de IgG3 en una placa de cultivo celular de 96 pocillos estériles , 1.000 células por pocillo en 200 mcl . Crecer durante una semana . Cosecha 100 mcl de los medios de comunicación y lo prueba con un ensayo ELISA de los 96 - y placas de ELISA con un anticuerpo de cabra anti - ratón de anticuerpos IgG1 sin etiqueta en tampón fosfato salino --- PBS.
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Escudo . Añadir los medios de comunicación e incubar 1 1/2 horas. Lavar las placas con PBS y añadir el anticuerpo secundario --- cabra anti-ratón anticuerpo IgG1 marcado con HRP . Incubar durante 1 1/2 horas. Lave después con PBS. Añadir sustrato de HRP y se incuba durante 30 minutos . Añadir solución de parada y leer con un lector de placas de ELISA a 450 nm .
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coincidir cualquier IgG1 -positivas así a la placa de cultivo celular original . Recoger las células de estos pozos y la placa 100 células por pocillo a una nueva placa de 96 pocillos de cultivo celular . Placa de cinco a 10 placas total. Crecer durante una semana y repetir el ensayo ELISA.
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células Placa de lo positivo así a una nueva placa de cultivo celular de 96 pocillos a una célula por pocillo. Placa de cinco a 10 placas total y crecer por dos semanas. Pantalla cada pozo sobre una base diaria para el crecimiento celular y marcar los pocillos que muestran una colonia de una sola célula . Esto asegurará que la línea de células productoras de IgG1 ha llegado a partir de una única célula y es idéntico . Repetir el ensayo ELISA.
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Repita el de una célula -por- bien enchapado de pozos positivos. Repetir el ensayo ELISA.
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células Harvest IgG1 - positivas y crecer en una placa de 24 pocillos . Inocular a un matraz de 25 ml , matraz de 75 ml y, finalmente, a un matraz de 125 ml . Una vez que tenga una población estable de células , crecen en un biorreactor de hibridoma para la producción a granel .
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Rehacer todo el protocolo a partir de las células productoras de IgG1 para obtener una línea celular IgG2b productoras . Una vez que tenga la línea celular IgG2b , repetir todo el protocolo una vez más para obtener la línea de células productoras de IgG2a . ¿Los ensayos de ELISA con anti-ratón anticuerpos IgG2a IgG2b o lugar de IgG1 , dependiendo de la subclase que está aislando .