Cómo hacer una línea celular estable

líneas celulares estables son células modificadas en el laboratorio para siempre expresan un cierto células gene.These ayudan a los científicos llevan a cabo análisis de la función del gen , el descubrimiento y validación de objetivos , el desarrollo del ensayo y la investigación de compuestos . Dependiendo del tipo de la expresión génica y la construcción génica ( también llamado un plásmido ) , hay muchos enfoques diferentes para el establecimiento de lines.Things celulares estables que necesitará
células
reactivo de transfección
plásmido de ADN con neomicina gen
antibiótico G418
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clonar el gen en un plásmido que codifica un gen de resistencia a los antibióticos ( neomicina : neo) . Si el ADN plásmido no tiene este gen , se puede co - transfectar otro plásmido con el gen neo . ( La transfección es la introducción de ADN en una célula receptora y la posterior integración del ADN en el ADN cromosómico de la célula receptora . ) Importancia de un gen de resistencia a los antibióticos es que después de la transfección , las células que no tienen el ADN plásmido morirán , y sólo las células que tiene va a crecer en medios de crecimiento antibiótico - impregnado .
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crecer las células que necesitan ser hecho estable hasta la fase logarítmica . Esta fase es cuando el número de células en un medio de cultivo aumenta de forma exponencial .

Necesita aproximadamente 1 millón de células por transfección. Estas deben ser las células adherentes , que son los que se fijan a la placa de cultivo de tejidos.
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Plate 1 millón de células en la placa de 10 cm de cultivo de tejidos 24 horas antes de la transfección.

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Siguiente días después de la siembra , transfectar 10 microgramos de ADN en las células usando el reactivo de transfección .
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Setenta y dos horas después de la transfección , utilizar tripsina , una enzima , para eliminar el las células de la placa de cultivo de tejido ( también llamado " trypsinizing " ) . Replate las células en seis placas de cultivo de tejido . El medio de crecimiento debe tener antibiótico G418 para la selección de neomicina.
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Tomará cerca de dos semanas para que las células crezcan . Siga cambiando el medio de cultivo con G418 u otro tipo de antibiótico .
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vez , las células han alcanzado el límite máximo que puede crecer en la placa de cultivo de tejidos, trypsinize y replate en diluciones. Mediante el uso de un anticuerpo adecuado , se puede cosechar algunos de ellos para confirmar la presencia del gen específico de interés .