Microscopía de fluorescencia Protocolos

Una sustancia fluorescente ilumina cuando es excitado por la luz de una longitud de onda específica . La fluorescencia se produce de forma natural en algunas sustancias como la clorofila, pero la mayoría tiene que adjuntar sondas fluorescentes llamados fluorocromos , o ser tratado con un producto químico fluorescente. La fluorescencia se utiliza para preparar ciertas estructuras biológicas para la detección y el análisis por microscopía . Microscopio fluorescente

El microscopio fluorescente funciona filtrando a través de sólo la luz con una longitud de onda específica de la muestra fluorescente, por lo general de un mercurio o una lámpara de xenón. La luz choca con la muestra, y los electrones se excitan y se mueven a un nivel orbital más alto. Cuando los electrones vuelven a su nivel normal, la energía se emite luz . Esto es menos brillante, con una longitud de onda más larga que la luz de excitación original, y se hace visible mediante el uso de un segundo filtro en el microscopio que separa la luz que emite la luz de excitación inicial.
Fijación

muestras se preparan primero antes de ser vistos en un microscopio de fluorescencia. Para las células y tejidos , esto se hace mediante la fijación . Fijación permite la organización estructural de la muestra a ser mantenido antes de la tinción con una sonda fluorescente . El uso de técnica de fijación depende de factores tales como el tipo de sonda fluorescente utilizada , y el tamaño o espesor de la muestra . Hay varias técnicas de fijación , incluyendo la precipitación, criofijación y reticulación
Fixation - . Entrecruzamiento

Cross -linking es una técnica de fijación común , donde se añade un reactivo que se une a componentes intracelulares de la muestra . Aldehídos tales como paraformaldehído y glutaraldehído se utilizan comúnmente como reactivos de fijación , y que forman enlaces covalentes con grupos amino de la muestra , a través de la reacción a base de ácido de Schiff . Los aldehídos se consideran un carcinógeno y deben ser manejados dentro de una campana de humos. Reactivos de reticulación se disuelven generalmente en un tampón apropiado tal como solución salina tamponada con fosfato ( PBS ) , que ayuda a mantener la celda cerca de su estado fisiológico normal sin interrumpir su estructura celular . Tampones contienen aminas no son recomendables ya que se unen al reactivo de reticulación .
Tinción

fluorocromos están diseñados generalmente alrededor de los compuestos aromáticos orgánicos que se unen a la biológica muestra. En muestras de células , fluorocromos también supervisan la viabilidad celular , incluyendo la apoptosis , la fluidez de membrana , endocitosis , exocitosis y la actividad enzimática . Fluorocromos comunes usados ​​en microscopía de fluorescencia son rodamina y manchas de Hoechst . Rodamina se utiliza para etiquetar una serie de moléculas biológicas, incluyendo ácidos nucleicos, proteínas , lípidos, carbohidratos , hormonas y toxinas . Rodamina tiene una alta fotoestabilidad , extinción, rendimiento cuántico fluorescente, y un bajo grado de formación de triplete . Los dos tipos de manchas Hoechst , 33258 y 33342 , se utilizan principalmente para etiquetar ADN. Ellos se pueden utilizar para teñir las células vivas y también pueden visualizar las mitocondrias y núcleos . Manchas Hoechst interrumpen la replicación del ADN durante la división celular , como resultado de la unión de su ADN y por lo tanto se consideran cancerígenos y mutagénicos.