Un Tutorial para PCR Primer Diseño

El diseño de la reacción en cadena de la polimerasa ( PCR ) primers es una habilidad que todos los científicos biológicos deben dominar . PCR es un procedimiento experimental ampliamente utilizado para amplificar segmentos de genes y generar miles de copias para su posterior análisis científico. Los cebadores de PCR son fragmentos cortos de ADN , denominados oligonucleótidos , diseñados específicamente para reconocer e hibridar a un segmento de ADN dentro de una pieza mucho más grande. Esto permite que otros ácidos nucleicos suministrados en la mezcla de reacción de PCR para unirse al cebador , y la secuencia de ADN diana reconocida para convertirse amplifica. Instrucciones
Un Tutorial para PCR Primer Diseño Matemáticas 1

Siempre busque cebadores existentes . Compruebe revistas científicas y bases de datos de imprimación , por ejemplo, primerdb , para primer secuencias que se han utilizado en otros experimentos y científicamente demostrado funcionar existente. Por desgracia , porque el diseño de cebadores y las reacciones de PCR son procesos difíciles , los científicos profesionales tienden a utilizar cebadores y parámetros de reacción que ya han sido publicados y validados experimentalmente .
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Encontrar un software de diseño de la cartilla . Uno de los más antiguos y más ampliamente utilizado es Primer3 , que está disponible gratuitamente como una herramienta web. Otros incluyen oligocalc , OLIGO 7 , PrimerQuest o OligoANALYZER . Preferiblemente , esto debería haber sido una herramienta recomendada a usted por un científico senior en la actualidad el uso de ella, porque todo el software de diseño de la cartilla tendrá desafíos técnicos y requieren solución de problemas por un biólogo molecular con experiencia . Cargue su secuencia del gen diana en el formato , por ejemplo , FASTA o texto, especificado por lo que el software se utiliza .
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Seleccione la secuencia dentro de su gen diana elegida , conocida como la ' plantilla. ' Mira la secuencia de varias regiones elegidas para la estructura secundaria ( regiones de la secuencia que se pliegan y se unen ) y evitarlos en lo posible. También evitar las regiones con más de cuatro bases idénticas consecutivas , es decir , se repite . Por último , asegúrese de que la GC actual, o guanina - citosina , el contenido no exceda del 60 por ciento .
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Ejecute el software de diseño de la cartilla . Especifique un primer longitud de 18 a 24 nucleótidos . Establecer parámetros tales como la temperatura de fusión para ser 55 a 80 grados centígrados , contenido de GC de 40 a 60 por ciento. Coloque una ' pinza GC ' al extremo 3 'de la secuencia del cebador escribiendo manualmente en una cadena de ' G ' o nucleótidos ' C ' . Agregar o quitar la ' G' o bases "C" hasta que la temperatura de fusión es aceptable.
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Realizar comprobaciones finales . Estos controles dependen del propósito original de la PCR para que los cebadores se están diseñando . Usted puede comprobar para la auto - hibridación o la formación de dímeros de primer , estructuras de horquilla o la especificidad de secuencia . Por ejemplo, si la PCR es detectar las mutaciones de una sola base , a continuación, debe comprobar que la imprimación reconoce sólo la plantilla está amplificando .