Técnicas de Du Pont Western Blot

Blot Du Pont Occidental es una técnica diseñada para contar la cantidad de proteína se ha acumulado en las celdas seleccionadas . Se utiliza electroforesis en gel para proteínas desnaturalizadas por la longitud de la cadena polipeptídica . La técnica original fue desarrollado en el laboratorio de George Stark en la Universidad de Stanford , y se le dio su nombre por W. Neal Burnette . Sin embargo , Western Blot no detecta con gran precisión cuando una proteína se degrada rápidamente. Finalidad de la técnica

Independientemente de si la proteína en cuestión se ha sintetizado in vivo (naturalmente) o in vitro ( en el laboratorio) , las técnicas de Du Pont Western Blot son capaces de detectar una proteína en un mezcla de cualquier número de proteínas. Ellos proporcionan información sobre el tamaño de la proteína en cuestión . El método es , sin embargo, depende de la provisión de un anticuerpo de alta calidad dirigido contra la proteína deseada. Una pequeña porción de la proteína debe ser capaz de ser creado a partir de un fragmento de ADN clonado, y este anticuerpo se utiliza para detectar la proteína de interés .
Llevar a cabo la técnica de

en primer lugar, las proteínas deben estar separados por tamaño mediante el uso de la técnica de electroforesis en gel. A continuación, una membrana de nitrocelulosa se ​​debe colocar sobre el gel , y la electroforesis se debe emplear para accionar las bandas de proteínas sobre la membrana de nitrocelulosa. Después de esto, la membrana de nitrocelulosa se ​​incuba utilizando un anticuerpo primario , que se pega a la proteína , a continuación, con un anticuerpo secundario . Este anticuerpo secundario se utiliza como un conjugado anticuerpo-enzima , y está destinado a pegarse al anticuerpo primario. Las funciones de la enzima conjugado para ayudar a visualizar lo que está ocurriendo .
Detección radiactiva

En la técnica de Du Pont Western Blot, la enzima clonada se puede ver en acción utilizando el método de detección radiactiva . En primer lugar, la enzima clonado debe incubarse en una mezcla de reacción que es específico de la enzima. Si el procedimiento se lleva a cabo adecuadamente , las bandas deben se hacen evidentes en el gel donde la proteína está en pruebas . Una película de rayos X se puede colocar sobre el gel para detectar destello de luz que se desprende por la enzima .
Colorimétrico de detección

Detección colorimétrica depende de la incubación del Western Blot con un sustrato diseñado para reaccionar con la enzima reportera , unido al anticuerpo secundario. Esto resulta en la conversión del colorante soluble en una forma insoluble que exhibe un color diferente que tiñe la membrana de nitrocelulosa .
Detección fluorescente

En el método de detección fluorescente, un sonda marcada es excitado por la luz, y la emisión de la excitación es detectada posteriormente por un fotosensor equipado con filtros de emisión apropiados . Esta captura una imagen digital de la Western Blot y permite además el análisis de datos . Se considera ser uno de los métodos más sensibles de detección de Western Blot actualmente disponibles.
Blotting Agente

Antes de añadir el anticuerpo primario , el gel nitrocelulosa debe incubarse utilizando una mancha . Albúmina de suero bovino ( BSA ) se utiliza a menudo , pero , tal vez sorprendentemente , Carnation leche descremada en polvo hace uno de los mejores agentes de transferencia .